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本制品是基于荧光探针法RT-LAMP技术开发的专门用于猪轮状病毒(PRV)研究检测的试剂盒。

猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PRV)是猪群中最常见的引起腹泻性疾病的主要病原。幼龄仔猪最为易感，1～4周龄仔猪发病率超过80%，死亡率达7%～20%，症状也较严重。同时，由于该病常与其他疾病混合感染，使病情加重，导致死亡率增高，给养殖户带来严重的经济损失。因此PRV的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。

1. 即开即用，用户只需要提供病毒RNA样品。
   
2. 恒温扩增，可以不需要贵重的荧光PCR等贵重仪器。
   
3. 含探针，可以进一步提高专一性。
   
4. 检测灵敏性可以达到100拷贝/反应左右。
   
5. 特异性高，扩增引物和检测探针均根据猪轮状病毒RNA保守序列设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
   
6. 一般30分钟内出结果，比RT-PCR快。
   
7. 提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
   
8. 提供内参，便于识别假阴性。
   
9. 上样量大，对20μL的反应体系，最大样品加样量高达到13μL。
   
10. 内含的dUTP-UNG可防交叉污染。

1. 本试剂盒仅可用于科研实验，严禁用临床诊断或其他医疗用途。
   
2. 本试剂盒只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。

首次使用本制品的时候，需要在引物探针混合液干粉管中加入60μL的自备超纯水，在阳性对照管和内参管中分别加入250μL和500μL超纯水，使得阳性对照和内参的浓度均为1×10⁴拷贝/μL。这些溶液用后还有剩余的需要放-20℃保存，阳性对照和内参由于是高浓度的模板，容易污染没有模板的Mix、引物探针混合液和水，因此需要在专门的场地进行稀释。

1. 用自选方法纯化样品RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
   
2. 如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照(PC)和一个样品制备阴性对照(NC)。PC用10μL本试剂盒提供的阳性对照(1×10⁴拷贝/μL)加一定量的水充当，总体积必须跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样品体积一样，NC用水替代。
   
3. N+2个样品的每个样品在纯化前，每个都要加入本试剂盒提供的10μL猪轮状病毒RT-LAMP内参(1×10⁴拷贝/μL)，相当于每个样品在进行核酸纯化前，含有1×10⁵个拷贝的内参分子。

4. 第一次使用一个新的试剂盒时，必须先将100μL逆转录酶-扩增酶混合液全部加入到探针法RT-LAMP MasterMix中，盖上盖子后轻柔颠倒1分钟混匀，然后再取用。
   
5. 反应设置：如果有N+2个RNA纯化样品，则最好设置N+5个RT-LAMP扩增，增加一个扩增阴性对照、一个内参对照和一个扩增阳性对照。在N+5个PCR管中加入下列成分。
   

   成分	N+2个样品管	扩增阴性对照	扩增阳性对照	扩增内参对照
   探针法RT-LAMP MasterMix(已加酶)	各6μL	6μL	6μL	6μL
   20×猪轮状病毒RT-LAMP引物探针混合液	各1μL	1μL	1μL	1μL
   N+2个样品RNA	各13μL	-	-	-
   超纯水	-	13μL	-	-
   猪轮状病毒RT-LAMP阳性对照(1×104拷贝/μL)	-	-	13μL	-
   猪轮状病毒RT-LAMP内参(1×104拷贝/μL)	-	-	-	13μL

6. 本制品含两种探针，故在设置荧光PCR仪时，设置60次循环，每次65℃保温1分钟，采集FAM和HEX两个通道的荧光信号。FAM是样本探针的荧光标记，HEX是内参探针的荧光标记，淬灭基团均是TAMRA。

7. 判断实验有效性：扩增阴性对照必须没有FAM信号的扩增(扩增是指Ct在40以内，荧光信号呈现标准的S型扩增曲线。任何一个不满足此两个条件，均判读为无扩增。下同)，扩增阳性对照必须有FAM信号的扩增，否则整个实验无效，需要分析原因。扩增阴性对照如果有扩增，表示实验试剂或环境有模板DNA的污染。扩增阳性对照没有FAM信号的扩增表示试剂盒或扩增设备或操作有问题，需要分别排查。找到原因并解决问题后方可重启实验。
   
8. 如果实验有效，则可以分析N+2个样品的情况。
   情况1：FAM信号有扩增，则此样品应判为阳性，不论HEX信号有无扩增。
   情况2：FAM信号无扩增，但HEX信号有扩增，则此样品应判为阴性。
   情况3：FAM信号和HEX信号均无扩增，此样品应判为假阴性(可能原因之一是此样品中有抑制物，也可能核酸在纯化过程中丢失)。此样品需要稀释不同倍数后再测或/和重新进行核酸制备。